Tipično, tumori se ispituju pomoću biopsija tkiva. Mali uzorak je preuzet iz tumora i genotipiziran, ili analiziran za genetsku šminku. Problem s ovim pristupom je da biopsijacijski tumori mogu biti izazovni. Nadalje, biopsija tumora daje samo snimku tumora.
Pisanje Discovery Medicine 2015. godine, Labgaa i koautori navode sljedeće o konvencionalnoj biopsiji tumora:
Iz očitih razloga, teško je pratiti evoluciju tumora sekvencijskim biopsijama. Također, biopsija samo odražava jednu točku tumora i zbog toga vjerojatno neće predstavljati cijeli spektar somatskih mutacija u velikim tumorima. Alternativa bi bila dobiti više biopsija za isti tumor, ali ova opcija nije ni realna niti točna. Tekuća biopsija uključuje mjerenje cirkulirajuće DNA (ctDNA) i drugih tumorskih nusprodukata u uzorcima krvi dobivenim od bolesnika s rakom. Ovaj novi dijagnostički pristup obećava da će biti brz, neinvazivan i isplativ.
Povijest tekuće biopsije
Godine 1948., Mandel i Métais, par francuskih istraživača prvi su identificirali ctDNA u krvi zdravih ljudi. Ovo otkriće bilo je ispred svog vremena, a tek nakon nekoliko desetljeća daljnja istraživanja ctDNA.
1977. Leon i njegovi kolege najprije su otkrili povećanu količinu ctDNA u krvi pacijenata s rakom.
Do 1989. Stroun i njegovi kolege identificiraju neoplastične (tj. Rak) karakteristike krvi. Nakon ovih otkrića, nekoliko drugih skupina identificiralo je specifične mutacije u tumorskim supresorima i onkogenima, mikrosatelitskoj nestabilnosti i DNA metilaciji, što je dokazalo da se ctDNA otpušta u cirkulaciju tumorima.
Iako znamo da ctDNA dobivena iz tumorskih stanica cirkulira u krvi, podrijetlo, brzina oslobađanja i mehanizam oslobađanja ove DNA su nejasni, a istraživanja daju sukobljene rezultate. Neka istraživanja pokazuju da više malignih tumora sadrži više stanica mrtvih karcinoma i oslobađa više ctDNA. Međutim, neka istraživanja sugeriraju da sve stanice otpuštaju ctDNA. Ipak, čini se vjerojatnim da kancerozni tumori oslobađaju povećanu razinu ctDNA u krv, stvarajući ctDNA dobar biomarker raka. Zbog teške fragmentacije i niskih koncentracija u krvi, ctDNA je teško izolirati i analizirati. Postoji neslaganje koncentracija ctDNA između uzoraka seruma i plazme. Čini se da je krvni serum umjesto krvne plazme bolji izvor ctDNA. U studiji Umetani i suradnika, utvrđeno je da koncentracije ctDNA su dosljedno niske u plazmi u odnosu na serum zbog mogućeg gubitka cirkulirajuće DNA tijekom pročišćavanja, jer koagulacija i drugi proteini eliminiraju tijekom pripreme uzoraka.
Prema Heitzeru i kolegama, ovdje su neka specifična pitanja koja treba riješiti kako bi se iskoristila dijagnostički potencijal ctDNA:
Prvo, predanalitički postupci moraju biti standardizirani …. Odabir metode izolacije koji osigurava ekstrakciju dovoljne količine visoko kvalitetne DNK je kritična i pokazalo se da predanalitički čimbenici uzimanja i prerade krvi mogu snažno utjecati na prinos DNA …. Drugo, jedno od najvažnijih pitanja je nedostatak usklađivanja metoda kvantificiranja. Različite metode kvantifikacije, … daju različite rezultate, jer ta mjerenja ciljaju ili ukupnu ili samo pojačanu DNA …. Treće, manje je poznato o podrijetlu i detaljan mehanizam oslobađanja ctDNA, te u većini studija zbunjuju događaji koji bi također mogli pridonijeti oslobađanju ctDNA.
Ciljani ili nerazvrstani pristupi
Trenutno postoje dva glavna pristupa za analizu krvne plazme (ili seruma) za ctDNA. Prvi pristup je usmjeren i traži specifične genetske promjene koje ukazuju na tumore. Drugi je pristup neciljan i uključuje analizu genoma koja traži ctDNA reflektirajuće od raka. Alternativno, exome sekvencioniranje je korišteno kao troškovno učinkovitiji, neciljani pristup. Exomes su dijelovi DNK koji su prepisani kako bi se stvorili proteini.
S ciljanim pristupom, serum se analizira za poznate genetske mutacije u malom skupu mutacija vozača.
Mutacije vozača odnose se na mutacije u genomu koji promiču ili "potiču" rast stanica karcinoma. Ove mutacije uključuju
KRAS
ili EGFR . Zbog tehnološkog napretka posljednjih godina, postignuti su ciljani pristupi analizi genoma za male količine ctDNA. Te tehnologije uključuju ARMS (amplifikacijski sustav refrakcije mutacije); digitalni PCR (dPCR); kuglice, emulzije, pojačanje i magnetika (BEAMing); i duboko sekvenciranje (CAPP-Seq).Iako su napredci u tehnologiji koji omogućuju ciljani pristup, ciljani pristup samo cilja na nekoliko položaja mutacija (vrućih mjesta) i nedostaje mnogo mutacija vozača kao što su tumori supresorski geni.
Glavna prednost neciljanih pristupa biopsiji tekućine je ta da se mogu koristiti u svim bolesnicima zbog činjenice da se test ne oslanja na povratne genetske promjene. Ponavljajuće genetske promjene ne pokrivaju sve vrste raka i nisu specifični znakovi raka. Ipak, ovaj pristup nema analitičku osjetljivost i sveobuhvatna analiza tumorskih genoma još nije moguća.
Napomenuvši, cijena sekvenciranja cijelog genoma bitno je pala. Godine 2006. cijena sekvencioniranja cijelog genoma bila je oko 300.000 USD (USD). Do 2017. trošak je pao na oko 1.000 USD (USD) po genomu, uključujući reagencije i amortizaciju strojeva za sekvenciranje.
Klinička korisnost tekuće biopsije
Inicijalni napori za korištenje ctDNA bili su dijagnostički i usporedili razinu u zdravih pacijenata s onima od pacijenata s rakom ili onih s benignom bolesti. Rezultati ovih napora bili su pomiješani, s tim da su samo neke studije koje pokazuju značajne razlike koje ukazuju na rak, stanje bez bolesti ili relaps.
Razlog zašto se ctDNA može koristiti samo neko vrijeme za dijagnosticiranje raka je zato što su varijabilne količine ctDNA izvedene iz tumora. Nisu svi tumori "istalo" DNA u istoj količini. Općenito, napredniji, rašireni tumori prolijevaju više DNA u cirkulaciju nego rani, lokalizirani tumori. Osim toga, različite vrste tumora razlijevaju različite količine DNA u cirkulaciju. Frakcija cirkulirajuće DNA koja je izvedena iz tumora je široko promjenjiva kroz studije i vrste raka, u rasponu od 0,01% do 93%. Važno je napomenuti da se općenito, samo manjka ctDNA izvodi iz tumora, a ostatak dolazi iz normalnih tkiva.
Cirkulirajuća DNA može se koristiti kao prognostički marker bolesti. Cirkulacijska DNA može se koristiti za praćenje promjena u raku tijekom vremena. Na primjer, jedna studija pokazala je da je dvogodišnja stopa preživljavanja u bolesnika s karcinomom debelog crijeva (tj. Broj pacijenata koji su još bili živi najmanje dvije godine nakon dijagnoze s kolorektalnim karcinomom) i
KRAS
hotspot mutacije bio 100 posto u onima bez dokaz odgovarajuće cirkulirajuće DNA. Štoviše, moguće je da se u skoroj budućnosti DNA koja cirkulira može koristiti za praćenje prekanceroznih lezija. Cirkulirajuća DNA također se može koristiti za praćenje odgovora na terapiju. Budući da cirkulirajuća DNA pruža bolju cjelovitu sliku genetske strukture tumora, ova DNK vjerojatno sadrži dijagnostičku DNA koja se može koristiti umjesto dijagnostičke DNA koja se dobiva od samih tumora. Sada bacimo pogled na neke specifične primjere tekuće biopsije.
Guardant360
Guardant Health razvio je test koji koristi sekvencioniranje nove generacije za profiliranje cirkulirajuće DNA za mutacije i kromosomske preuređivanja za 73 gene povezane s rakom. Guardant Health objavio je studiju koja izvještava o upotrebi tekuće biopsije u onkologiji. Istraživanje je koristilo uzorke krvi od 15.000 bolesnika s kombiniranim 50 tipova tumora.
Većinom su rezultati testiranja biopsije tekućine usklađeni s promjenama gena promatranim u biopsijama tumora.
Prema NIH:
Guardant360 je identificirao iste kritične mutacije u važnim genima povezanim s rakom poput
EGFR, BRAF,
KRAS i PIK3CAna frekvencijama vrlo slične onima koje su prethodno identificirane u uzorcima biopsije tumora, statistički povezujući s 94% do 99%. Nadalje, prema istraživanju NIH-a, istraživači su izvijestili o sljedećem: U drugoj komponenti istraživanja, istraživači su procijenili gotovo 400 bolesnika – od kojih je većina imala rak pluća ili kolorektalnog – koji su imali i rezultate DNA krvi DNA i tumorskih tkiva usporedili su obrasce genomske promjene. Ukupna točnost tekuće biopsije u usporedbi s rezultatima analize biopsije tumora bila je 87%. Točnost je povećana na 98% kada su uzorci krvi i tumora prikupljeni unutar 6 mjeseci jedan od drugoga.
Guardant360 je bio točan iako su razine cirkulirajuće DNK u krvi bile niske. Često, cirkulirajuća tumorska DNA činila je samo 0,4 posto DNK u krvi.
Sveukupno, upotrebom tekuće biopsije, istraživači Guardanta bili su u stanju identificirati marker tumora koji bi mogao liječiti liječnika u 67 posto pacijenata. Ti pacijenti su imali pravo na tretmane odobrene od strane FDA, kao i na terapijske postupke.
ctDNA i karcinom pluća
2016. godine, FDA je odobrila test za cobas EGFR mutiranje koji će se koristiti za otkrivanje
EGFR
mutacija u cirkulirajućoj DNK bolesnika s rakom pluća. Ovaj test je bio prva FBI-om odobrena tekućinska biopsija i identificirala pacijente koji mogu biti kandidati za liječenje ciljnim terapijama primjenom erlotiniba (Tarceva), terminabin (Gilotrif) i gefitinib (Iressa) kao prve linije liječenja i osimeritinib (Tagrisso) kao drugo liječenje. Te ciljane terapije napadaju stanice raka s specifičnimEGFRmutacijama. Važno je, zbog velikog broja lažno negativnih rezultata, FDA preporučuje da se uzorak biopsije tkiva uzima i od pacijenta koji ima negativnu tekuću biopsiju. ctDNA i karcinom jetre
Broj ljudi koji umiru od raka jetre povećao se tijekom proteklih 20 godina. Trenutno, rak jetre je drugi vodeći uzrok smrti od raka u svijetu. Nema dobrih biomarkera dostupnih za otkrivanje i analizu jetre, ili hepatocelularnog (HCC), raka. Cirkulacijska DNA može biti dobar biomarker za rak jetre.
Razmotrite sljedeću citat iz Lagbae i koautora o potencijalu korištenja cirkulirajuće DNA za dijagnosticiranje raka jetre:
Hypermetilacija RASSF1A, p15 i p16 predložena su kao rani dijagnostički alati u retrospektivnoj studiji uključujući 50 pacijenata s HCC. Potpisao je četiri aberantski metilirana gena (APC, GSTP1, RASSF1A i SFRP1) također testirana na dijagnostičku točnost, dok je metilacija RASSF1A prijavljena kao prognostički biomarker. Naknadne studije analizirale su ctDNA u pacijentima s HCC-om koji koriste dubinske tehnologije sekvenciranja … Nevjerojatno, aberantni DNA brojevi kopija otkriveni su u dva HBV nosača bez prethodne povijesti HCC u vrijeme sakupljanja krvi, ali koji su razvili HCC tijekom praćenja. Ovaj nalaz otvorio je vrata za procjenu varijacija broja kopija u ctDNA kao alata za screening za rano otkrivanje HCC.
Riječ od Verywell
Tekuće biopsije su uzbudljiv novi pristup genomskoj dijagnozi. Trenutno, određene tekuće biopsije, koje nude sveobuhvatno molekularno profiliranje, dostupne su liječnicima da nadopunjuju genetske informacije dobivene iz biopsije tkiva. Postoje i određene tekuće biopsije koje se mogu koristiti umjesto biopsije tkiva – kada biopsija tkiva nedostupna je.
